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        寧波材料所在熒光納米微球生物標記探針及POCT應用方面取得系列進展
        作者:,日期:2022-08-30

          準確、高靈敏且快速的檢測技術(Point of Care Testing,POCT)是疾病診斷、食品安全、環境監測等生命健康相關領域的重要保障。檢測技術包括信號(光、電、磁等)產生單元、分子識別單元、信號輸出單元三個模塊及相關試劑與分析平臺,其中,信號產生單元是檢測技術研發的核心,主要涉及生物標記探針,其決定技術原理與靈敏度。憑借高靈敏、可視化、無損檢測的優勢,熒光技術在POCT領域獲得了廣泛的認可。然而,生物樣本中背景熒光、散射光等光學干擾會顯著降低信噪比,導致其在低豐度靶標的樣本檢測上受限。針對上述問題,中國科學院寧波材料技術與工程研究所基因與體外診斷技術團隊鄭建萍研究員和王宇輝副研究員在新型熒光納米微球標記探針及其快速檢測應用方面取得系列進展。

          近紅外激發的稀土上轉換發光技術可有效避免待檢樣本中背景熒光等光學干擾,顯著提高靈敏度。但是,上轉換發光納米微球(UCNPs)的水溶性修飾與生物功能化會導致表面狀態的改變與熒光衰減。針對該問題,團隊發展了一種超分子(葫蘆脲[7])自組裝修飾UCNPs的技術,其提高了UCNPs的水溶性、光穩定性及抗體錨定效率。作為一種標記探針,超分子功能化的UCNPs在免疫層析檢測卡中表現出明顯的競爭優勢,對達氟沙星抗生素和大腸桿菌(O157:H7)的檢出限分別達到0.04ng/mL, 7×102cfu/mL,最終成功應用于牛奶樣本中靶標的現場快速篩選(圖1)。相關成果以“Improving the performance of up-conversion nanoprobe-based lateral flow immunoassays by supramolecular self-assembly core/shell strategies”為題發表在Sensors and Actuators B: Chemical., 2020, 318, 128233https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128233)。

          分子信標是一種基于熒光共振能量轉移(FRET)的均相核酸檢測技術,具有設計簡單、特異性好的優勢,其靈敏度取決于熒光供體的光學性能及供受體間的能量轉移效率。針對常見分子信標存在的背景干擾、靈敏度偏低及有機磷光供體分子水溶性差等問題,團隊發展了一種新型的近紅外長余輝分子信標探針檢測技術(圖2)。利用樣本中本底熒光與長余輝探針(PLNPs)在壽命上的差異,時間分辨技術可徹底消除背景信號。所構建的長余輝分子信標對miR21的檢測靈敏度達到0.086nM,比近紅外商用染料探針高1-2個數量級,并成功應用于血樣與胞內miR21水平的實時快速、定量篩選,充分展示了長余輝時間分辨技術在生物檢測上的優勢。相關成果以“A persistent luminescence resonance energy transfer-based molecular beacon probe for the highly sensitive detection of microRNA in biological samples”為題,發表在Biosensors and Bioelectronics, 2022, 198, 113849 (https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113849)。

          盡管上述具備特殊發光性質的長余輝/上轉換發光納米材料與在克服背景干擾,提高檢測信噪比方面具有獨特優勢,但是,存在光量子效率低、需要特定激發光源或檢測器等局限,使得相關便攜式熒光定量分析儀的開發成本顯著提高。熒光碳點憑借制備簡單、發光性能好、化學惰性、易表面修飾等優點,是一類有潛力和競爭力的標記材料。然而,碳點的極小尺寸(<5nm)會帶來兩個問題,一是表面有限的生物修飾位點,且生物偶聯時會存在單個抗體同時偶聯上多個碳點而導致熒光淬滅;二是單個碳點的熒光強度整體相對偏弱。

          針對上述問題,團隊在前期熒光碳點標記探針及分析應用的研究基礎上(Biosens. Bioelectron.,(2017, 90, 501; 2017, 97, 150); Anal. Chem.,2017, 89, 5542; Nanoscale(2018, 10, 17834; 2018, 10, 1532); Chem. Eur. J., 2018, 24, 4703; Analyst,(2019, 144, 468; 2020, 145, 2982.)),分別基于碳化交聯與介孔硅負載技術,合成制備了熒光碳納米微球(FCNBs)和碳點-介孔硅共價復合熒光微球(CD-MSNs),并開展了其在免疫標記分析中的應用研究。FCNBs以有機小分子與枝狀聚乙烯亞胺(PEI)為原料,通過溶劑熱一步碳化交聯而獲得,其制備簡單、水溶性好、尺寸均勻(50-70nm)、光量子效率高(90.1%)、表面具有豐富的功能基團,特別適宜生物標記?;诿庖哂H和與核酸適體分子識別原理(圖3),分別設計和構建了基于競爭法和夾心法檢測黃曲霉毒素1(AFB1)與金黃色葡萄球菌(S. aureus)的熒光層析技術與試紙條,相應的定量檢出限分別達到0.01ng/mL、102cfu/mL,比現有膠體金、商用熒光微球低1-2個數量級,相關研究成果“An Emerging Fluorescent Carbon Nanobead Label Probe for Lateral Flow Assays and Highly Sensitive Screening of Foodborne Toxins and Pathogenic Bacteria”為題,發表在Analytical Chemistry, 2022, 94, 11514-11520 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01430)。CD-MSNs利用介孔硅獨特的孔道結構,共價負載高密度的硅烷化碳點,顯著提高了探針的熒光強度,且有效避免包埋微球中常出現的熒光泄露問題。該熒光微球尺寸均勻(240 nm)、分散性好、易表面功能化,同樣適用于生物標記?;诿庖咦R別原理(圖4),分別制備了AFB1與S. aureus的試紙條,相應的定量檢出限達到0.05ng/mL、102cfu/mL,可實現單液滴下1個S. aureus菌落的檢出,相關研究成果以“An ultrasensitive lateral flow immunoassay platform for foodborne biotoxins and pathogenic bacteria based on carbon-dots embedded mesoporous silicon nanoparticles fluorescent reporter probes”為題,發表在Food Chemistry, 2023, 399, 133970https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133970)。上述熒光檢測卡均成功應用于食品樣本(牛奶、肉制品、花生、豆類等)中污染因子的高靈敏、快速篩選。

          以上研究得到浙江省自然科學基金(LY20B050003)、寧波市3315創新團隊項目(2019A-14-C)、寧波市科技攻關重大專項(2016C50009,2018B10054)等項目的資助。此外,南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室賴衛華教授、上海理工大學周化嵐博士、中國農科院油料所李慧副研究員等合作者參與了部分工作。

        圖1 稀土上轉換發光粒子及其免疫層析技術構建示意圖

        圖2 長余輝分子信標探針的構筑與miR21傳感原理示意圖

        圖3 FCNBs探針制備、競爭法檢測AFB1原理及實際樣本篩選應用

        圖4 碳點-介孔硅共價復合熒光微球標記探針構建及其免疫層析應用

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        被店长侵犯的未婚妻石原

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